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人参皂苷Rh2 对荷Lewis 肺癌小鼠抗肿瘤作用

2014-08-04

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导读:G-Rh2 可抑制Lewis 肺癌生长及抑制肿瘤新生血管生成的作用,可能是通过降低VEGF 表达来实现的。

摘要:目的 观察人参皂苷Rh2 (ginsenoside Rh2,G-Rh2) 对荷Lewis 肺癌小鼠抗肿瘤作用并探讨其作用机制。方法 建立Lewis 肺癌实体瘤模型,观察G-Rh2 的抗肿瘤作用、观察肿瘤内血管密度(MVD),以及免疫组化法观察瘤体血管内皮生长因子(VEGF) 的表达。

结果 0.3 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1 和3.0 mg·kg-1 G-Rh2 组对Lewis 肺癌小鼠实体瘤均有抑制作用(P<0.05);1.0 mg·kg-1 和3.0 mg·kg-1 G-Rh2组MVD 明显低于对照组 (P<0.05);免疫组化结果显示,0.3 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1 和3.0 mg·kg-1 G-Rh2组瘤组织内的VEGF 蛋白表达阳性率均低予对照组 (P<0.05)。

结论 G-Rh2 可抑制Lewis 肺癌生长及抑制肿瘤新生血管生成的作用,可能是通过降低VEGF 表达来实现的。

关键词:人参皂苷;Lewis 肺癌;血管密度;血管内皮生长因子

前 言

人参皂苷Rh2(ginsenoside Rh2,G-Rh2) 是从人参中提取的天然活性成分,体按照其苷元骨架类型属于人参二醇型。G-Rh2 可以调节肿瘤细胞信号通路系统,即细胞接受外界信号,将细胞外的信号传导为细胞内信号,最终调节特定基因表达,并引起细胞的应答反应来抑制肿瘤细胞生长。人参皂苷Rh2 作为免疫调节因子,还可促进白蛋白、γ 球蛋白的合成,提高T 细胞和巨噬细胞的功能,因而能抑制肿瘤细胞的增殖,同时还能抑制正常淋巴细胞染色体突变,稳定免疫系统,达到抗肿瘤效果。最近研究发现人参皂苷Rh2 可以作为肿瘤耐药逆转剂提高化疗药物的抗肿瘤活性。一般的化疗药物不易进入癌细胞,癌细胞中有种P- 糖蛋白可将化疗药物排出,造成癌细胞对化疗药物产生耐受性差,Rh2具有可亲水及亲油的特性,可以轻易进入细胞核内而杀死癌细胞。Rh2 能够通过不同途径诱发脑胶质瘤,肝癌等多种癌细胞凋亡,恢复正常细胞增殖,有效的诱导肿瘤细胞凋亡;它也通过诱导分化凋亡,使癌细胞不仅在形态上出现分化改变,而且在功能上也出现了分化改变,最终使癌细胞重新向正常细胞演变,甚至完全转变成正常细胞,它作为肿瘤生物治疗学的一个新领域,已日益受到关注。最近研究证实,G-Rh2 可以通过诱导分化或凋亡,抑制多种肿瘤细胞的生长与增殖,同时对正常细胞的毒性甚低,有望成为一种有效的抗肿瘤药物[1,2]。本文以Lewis 肺癌小鼠为模型,观察了G-Rh2 对Lewis肺癌小鼠的抗肿瘤作用,以及观察 VEGF 的表达和MVD 的数目,探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 昆明种小鼠,体重20±2 g,购自江西中医学院动物中心,清洁级实验室喂养。20(S)G-Rh2 和Lewis 肺癌细胞为江西中医学院中药制剂教育部重点实验室惠赠;环磷酰胺粉剂,江苏恒瑞医药股份有限公司;免疫组化试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 移植瘤模型的建立 取小鼠4 只,体重202g,从液氮罐中取出Lewis 肺癌细胞解冻,用无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×106·mL-1 瘤细胞悬液,在无菌操作下对小鼠进行腹腔接种,待腹水生长旺盛时,抽取约3~5 mL 腹水( 乳白色) 放入无菌容器内( 冰浴袋上操作),加无菌生理盐水稀释,然后用细胞离心机以转速1500 r·min-1 离心5 min,用蒸馏水冲洗2 次后,收集细胞,经台盼蓝排斥试验检查,细胞成活率95%以上,加无菌生理盐水调整为瘤细胞浓度2×107·mL-1,然后在小鼠腋下皮下注射,每只接种0.2 mL。

1.3 实验分组 小鼠于接种48 h 后称重分组,随机分为5 组,每组 10 只,对照组给以等量生理盐水注射;G-Rh2 组( 给药量分别为0.3 mg·kg-1、1.0mg·kg-1 和3.0 mg·kg-1);环磷酰胺组( 给药量为20mg·kg-1),腹腔注射(ip) 给药,0.2 mL· 只-1,每日1 次,连续注射10 d,停药后次日断颈处死小鼠,剥瘤称重,计算肿瘤生长抑制率( IR) 。抑瘤率 ( %) =(对照组平均瘤重- 治疗组平均瘤重)/ 对照组平均瘤重 ×100%

1.4 MVD 观测 瘤体剥离后,切取标本,组织块经10%多聚甲醛固定后,石蜡包埋,5μm 厚连续切片。MVD 制片染色方法( 见试剂盒说明)。肿瘤组织血管内皮细胞为棕黄染色,瘤灶内微血管染色部位主要出现在邻近坏死组织的边缘和肿瘤的边缘。MVD 的测定:先在低倍视野下选取肿瘤微血管最丰富的区域,即“热点”,再在400 倍视野范围计数被染成棕色的微血管数目,取3 个数值的平均值作MVD 值。任何棕染的内皮细胞或内皮细胞簇,只要与临近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开,就视为一个血管,尽管血管腔常可看到,但并不作为判断血管的标准。为了避免较大血管对计数的干扰,对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔>8 个红细胞面积的血管不予计数。

1.5 免疫组化法检测VEGF 蛋白表达 瘤体剥离后,切取标本,组织块经10%多聚甲醛固定后,石蜡包埋,5 μm 厚连续切片。VEGF 蛋白制片染色方法( 见试剂盒说明)。经染色后的切片,内皮细胞褐染,血管呈黄褐色,易于辨认。显微镜下观察间质中血管数目变化。免疫组化阳性着色为棕黄色,VEGF蛋白主要位于肿瘤细胞的新生毛细血管和部分肿瘤细胞膜/ 浆着色。检测结果判定采用4 级半定量积分法,即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅计分,着色比例10%以下1 分,10%~50%为2分,50%以上为3 分。着色程度:无着色为0 分,浅黄色为1 分,棕黄色为2 分,棕褐色为3 分,然后根据二者乘积判断阳性等级,O 为阴性( 一),l、3 分为弱阳性(+),4、6 分为(++),7、9 分为(+++)。

1.6 统计学分析 采用SPSS13.0 软件处理数据,计量资料组间比较采用方差分析,计数资料采用卡方检验。以P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 G-Rh2 对Lewis 肺癌小鼠实体瘤的抑制作用 G-Rh2 用药组瘤重明显低于对照组,0.3 mg·kg-1组即显示出明显的作用,具有统计学意(P<0.05),且随着剂量的增加其作用也有增加趋势,可见G-Rh2具有明显地抑制Lewis 肺癌生长的作用(表1)。

2.3 G-Rh2 对Lewis 肺癌小鼠肿瘤组织VEGF 蛋白表达的影响 G-Rh2 用药组VEGF 蛋白表达阳性率明显低于对照组(P<0.05),随着剂量的增加VEGF 阳性率越低 ( 表3)。

3 讨论

人参作为中国传统中药,在中药史上占有重要的地位,具有大补元气,补气益肺,安神益智的功效,被用于多种古方验方的主药。现代医学研究表明,人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用[3]。人参皂苷为人参主要活性成分,人参皂苷苷单体按照其苷元骨架类型分为三大类[4]。G-Rh2 是人参皂苷新发现的一种,已证实G-Rh2对肿瘤生长具有抑制用,其作用机制主要通过是通过诱导肿瘤细胞凋亡、分化、抑制肿瘤细胞转移、增强宿主免疫功能等机制而发挥抗肿瘤作用。人参皂苷又是一种低毒的抗癌药物。因此,有关G-Rh2 抗肿瘤机制的研究目前已成为抗癌中药研究的一个热点。本实验发现G-Rh2 用药组对Lewis 肺癌小鼠实体瘤均有抑制作用,并呈现一定的剂量- 效应关系,其中G-Rh2 高剂量组瘤重明显小于对照组(P<0.01)。结果表明苦参G-Rh2 具有提高Lewis 肺癌小鼠生存质量,相对与环磷酰组,具有较小的毒副作用。

研究发现了新生血管的生成在肿瘤生长中起着重要作用,肿瘤的生长取决于血管生成,肿瘤血管生成是实体瘤的产生、发展和转移过程中极为关键的步骤[5]。而评价肿瘤血管生成程度的最客观标准是肿瘤组织内的微血管数目[6],本实验通过Lewis肺癌小鼠模型发现,G-Rh2 用药组MVD 均低于对照组,其中以3.0 mg·kg-1 和1.0 mg·kg-1 G-Rh2 组效果非常显著(P<0.05),0.3 mg·kg-1 组效果不明(P>0.05)。结果表明G-Rh2 可降低Lewis 肺癌小鼠瘤组织中的微血管数目可以推断,G-Rh2 具有一定的抑制新生血管生成的作用。

此外,肿瘤血管的由调控因子所控制,其中正性调控因子主要有bFGF、VEGF、PD-ECGF 等[7-8]。近年研究发现在肿瘤血管生成因子中,VEGF 可直接刺激内皮细胞(ECs) 分裂增值最直接参与诱导肿瘤血管生成[9-10]。本实验发现,G-Rh2 用药组和环磷酰胺组瘤组织内的VEGF 蛋白表达阳性率和平均染色强度均低予对照组,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。G-Rh2 高剂量组瘤组织内的VEGF阳性率和平均染色强度明显低于对照组,组间差异性显著(P<0.01)。结果提示:G-Rh2 可降低Lewis肺癌小鼠瘤组织中VEGF 蛋白的表达。可以推断G-Rh2 可以抑制瘤组织VEGF 蛋白表达,抑制瘤细胞释放VEGF,从而抑制肿瘤血管生成。

总之,G-Rh2 可抑制Lewis 肺癌生长及抑制肿瘤新生血管生成的作用,可能是通过降低VEGF 表达来实现的。

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