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前列腺癌分子诊断标记物的应用

2017-11-14

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导读:前列腺癌是一种发病率颇高的泌尿系统恶性肿瘤。在世界范围内,前列腺癌的发病率在男性恶性肿瘤中位居第二

    前列腺癌是一种发病率颇高的泌尿系统恶性肿瘤。在世界范围内,前列腺癌的发病率在男性恶性肿瘤中位居第二,而在美国,前列腺癌的发病率已于2010年超越肺癌,成为第1位危害男性健康的肿瘤。在美国,仅2010年就有217730例新发前列腺癌病例,其中32050例死于该病。在我国,前列腺癌的发病率近年来也呈现上升趋势,1993年,前列腺癌发病率为1.71人/10万人,死亡率为1.2人/10万人,1997年,前列腺癌发病率为2.0人/10万人,至2000年,前列腺癌发病率已上升至4.55人/10万人。2007年,上海市疾病预防控制中心报道的男性前列腺癌发病率为11.81人/10万人,居男性恶性肿瘤第5位。

    目前临床上对于前列腺癌的早期诊断或筛查,主要依赖血清前列腺特异性抗原(PSA)水平。然而作为早期诊断的标记物,PSA仍然缺乏最佳的特异性和敏感性。因此,寻找新的前列腺癌分子诊断标记物来辅助或最终替代PSA作为前列腺癌的早期诊断标记,一直是临床工作者研究的热点。

    一、基因检测在前列腺癌分子诊断标记物探索中的应用

    众所周知,很多疾病的发生和发展,除环境因素外,还与患者自身的遗传特性有着密切的关系,因此,在基因层面寻找前列腺癌分子标记物是人们很自然而然想到的方法。目前,已有一定数量的基因位点被认为可能与前列腺癌的发生有关。

    1.遗传性前列腺癌基因区域1(HPC1):位于1号染色体(1q24~25),是前列腺癌的一个重要基因易感区,在1q25位点存在2-5A合成酶依赖性基因(RNASEL)。该基因的改变,被认为与前列腺癌的发生存在着密切的关系。同时R?kman等[5]的研究也证实,RNASEL中E265X片段的丢失和R462Q错义突变与前列腺癌发病率的升高有关。可见,该基因区域具有成为前列腺癌分子诊断标记的潜力。

    2.TMPRSS2-ETS融合基因:TMPRSS2编码一种雄激素依赖性的转膜丝氨酸蛋白酶。而ETS编码的转录因子可以调节很多与癌症相关的生物过程。目前已有文献报道,前列腺癌组织中广泛存在着位于21号染色体(21q22.3)的TMPRSS2-ETS融合基因。该融合基因使ETS基因借助TMPRSS2基因的启动子被激活,从而启动了ETS转录因子在癌症发生、发展过程中的作用。目前,已有更多的学者在研究前列腺癌患者白细胞及其他组织细胞中这一融合基因的出现率,如果得出具有统计学意义的结果,则该融合基因可以作为前列腺癌早期诊断甚至预测的标记。

    3.肿瘤抑制基因CpG岛高甲基化:位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛的高甲基化是一个重要的基因失活机制。这一改变会破坏细胞信号通路的关键环节而导致恶性转化和肿瘤演进,该机制几乎存在于所有肿瘤中。一系列研究证明检测异常高甲基化在肿瘤检测和进展预测中具有很大的应用前景。目前研究表明,90%的前列腺癌中存在谷胱甘肽S转移酶P1基因(GTSP1)高甲基化,它是前列腺癌中最常见的表观遗传学改变。有研究报道,联合检测GSTP1和APC基因的高甲基化,对前列腺癌的诊断敏感性高达98.3%,特异性为100%。而更重要的是,这一检测目前已经可以通过血清标本实现,这就为这一研究的临床应用开辟了更为广阔的空间。

    上述研究主要是通过定量RT-PCR等“传统”方法来进行的。而近年来,全基因组相关性研究(GWAS)的迅猛发展,为前列腺癌发生相关基因的筛选提供了新的手段。这一技术是一种检测特定物种中不同个体间的全部或大部分基因,从而了解不同个体间的基因变化有多大的一种方法。目前已有数十篇通过GWAS技术筛选前列腺癌发病相关基因的文献发表,被报道的相关基因达数十个,但尚未发现其中的某一基因在诊断前列腺癌方面显着优于其他基因。不过,随着GWAS技术的进一步发展,参与机构的增加以及病例数的累积,相信在不久的将来,即可筛选出可以用于诊断前列腺癌的标志性基因。

    二、蛋白质芯片在前列腺癌分子诊断方面的贡献

    蛋白质芯片曾经在多种疾病分子诊断标记物的筛选研究中风靡一时。但近年来,随着更多新技术的发展,这一研究手段的“地位”已大不如前。但是,我们不应遗忘该技术为前列腺癌分子诊断标记物的探索所作出的贡献。Gelmann等对PubMed上公布的芯片研究结果进行了荟萃分析,比较了前列腺癌组织和正常组织,显示了两者之间一系列差异和共同点。以下分子标记物的筛选,均是通过这一技术实现的。

    1.前列腺癌抗原3(PCA3):PCA3是近年来备受关注的前列腺癌分子诊断标记物之一。编码这一蛋白的基因位于9号染色体上(9q21~22)。Hessels等首先报道了通过检测尿液中PCA3的浓度来诊断前列腺癌的案例。有报道称,该蛋白在诊断前列腺癌方面的灵敏度和特异度分别为65%和66%,优于经典的标志物PSA。

    2.早期前列腺癌抗原(EPCA):EPCA是一种核基质蛋白。在前列腺癌与对照人群中EPCA染色强度具有统计学差异,其敏感性和特异性分别为84%和85%;同时发现具有病理阴性但抗EPCA抗体染色阳性活检组织的男性在将近5年或5年后被诊断为前列腺癌。因此,该蛋白不但具有诊断前列腺癌的作用,甚至可以用于前列腺癌发病的预测。

    三、同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术在筛选前列腺癌分子诊断标记物中的应用

    iTRAQ是2004年美国应用生物系统公司推出的一种利用同位素标签标记技术可以同时对相同实验条件下4个样本进行定量研究的蛋白质组学技术。iTRAQ实际上是一种同位素标记试剂,包括一个带电荷的报告基团,报告基团有四种相对分子质量分别为114Da、115Da、116Da和117Da,另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团,平衡基团也有四种相对分子质量分别为31Da、30Da、29Da和28Da。其中平衡基团平衡相对分子质量,保证与每一种报告基团结合后iTRAQ试剂总的相对分子质量都是145Da;肽段反应基团可以同肽段的N-末端和赖氨酸侧链ε-氨基基团发生反应,这样可以标记生物样品产生的所有肽段,增强任一给定蛋白的肽段覆盖度,同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息。以四个样本为例,实验流程为:每个样本进行还原、烷基化及胰蛋白酶水解处理后,所有肽段进行iTRAQ试剂标记,然后将所有样品混合在一起进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。标记的母体肽段经过碰撞诱导的解离后,报告基团表现为分子量在114、115、116、117Da的报道离子,而且同时产生残存的y-和b-离子化标记肽段。这些报道离子主要用于蛋白质的相对定量。因为报道离子主要分布在低分子量区,一方面尽可能的忽略自身的重量,降低不同质谱鉴定模式产生的差异;另一方面消除其他离子化片段的干扰,保证肽段丰度最高的可信度。因此报道离子丰度的差异,代表了不同样本中同一肽段丰度的差异,从而最终确定不同样本中同一蛋白质丰度的差异即相对定量信息。而y-和b-离子化标记肽段主要用于蛋白质鉴定。

    Glen等首次利用iTRAQ技术对前列腺癌细胞系进行蛋白质组学研究,最终发现了10种蛋白存在上调,4种蛋白存在下调,存在差异表达的脑肌酸激酶(CKBB)、儿茶酚胺邻位甲基转移酶(COMT)、肿瘤排斥抗原(gp96)、葡萄糖调节蛋白78kDa(grp78)等已通过Western-blot和2DGE进一步得到了验证。

    笔者同样通过这一技术,对中国人群中前列腺癌患者、前列腺上皮内瘤变(PIN)患者、良性前列腺增生(BPH)患者前列腺穿刺标本中各种蛋白的差异性进行了分析,最终发现了TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu在前列腺癌中分别上调4.25倍、4.57倍和3.02倍,而Decorin下调0.43倍。Western-blot的验证结果与iTRAQ的分析结果相一致。

    因此我们可以认为,iTRAQ技术在前列腺癌分子标记物的筛选中具有很大的潜力。

    除了上述技术外,尚有免疫组化等方式可对前列腺癌患者与对照组中蛋白的差异进行研究。相信随着各种实验手段的发展,我们会找到更多的手段来寻找更具临床意义的差异表达蛋白。

    四、总结与展望

    综上所述,前列腺癌的诊断目前仍依赖于PSA的检查。虽然很多新的分子诊断标记物(包括特定基因位点、差异蛋白等)已经越来越多地被报道,但目前还都处于研究阶段,正式应用于临床尚需时日。不过,随着研究的进展,被报道的标记物或研究手段会进一步增加,这将为我们提供了一个巨大的“候选库”,而从中筛选出最理想的前列腺癌分子诊断新标记也将不再困难。相信在不久的将来,我们可以找到一种或几种具有高敏感性、高特异性,易于提取、检验的标记物,从根本上解决前列腺癌诊断中的种种困境,为广大男性的健康做出新的贡献。

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